1、范圍

 

    本文件描述了飼料添加劑淫羊藿提取物中黃酮醇苷的高效液相色譜測定方法。

 

    本文件適用于飼料添加劑淫羊藿提取物中5種黃酮醇苷(淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定 B、朝藿定C和寶藿苷D)的測定。

 

    本文件中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷定量限均為0.2g/kg。

 

 

2、規范性引用文件

 

    下列文件中的內容通過(guò)文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

 

    GB/T6682分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法

 

    GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備

 

 

 

 

3、術(shù)語(yǔ)和定義

 

    本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義

 

 

4、原理

 

    試樣中的黃酮醇苷用甲醇溶液提取,高效液相色譜儀測定,外標法定量

 

 

5、試劑或材料

 

    除非另有規定,僅使用分析純試劑:

 

5.1  水:GB/T6682,一級。

5.2  甲醇:色譜純。

5.3  乙腈:色譜純。

5.4 70%甲醇溶液:量取700mL甲醇(5.2)于1000mL,容量瓶中,加水定容,混勻。

 

5.5  標準儲備溶液(2mg/mL):準確稱(chēng)取淫羊藿苷(CAS:489-32-7,純度>96%)、朝藿定A(CAS110623-72-8,純度>95%)、朝藿定B(CAS:110623-73-9,純度>95%)、朝藿定C(CAS:110642-44-9,純度>95%)、寶藿苷I(CAS:113558-15-9,純度>95%)各20mg(精確至0.01mg),分別置于10ml,棕色容量瓶中,用甲醇(5.2)溶解并定容,混勻。-18℃以下保存,有效期3個(gè)月。

 

5.6  混合標準中間溶液(200mg/1):分別準確移取標準儲備溶液(5.5)各1ml于10ml,棕色容量瓶中,用70%甲醇溶液(5.4)定容,混。于2℃~10℃保存,有效期3個(gè)月。

 

5.7  混合標準系列溶液:準確移取適量混合標準中間溶液(5.6),用70%甲醇溶液(5.4)配制成質(zhì)量濃度分別為0.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L和200 mg/L混合標準系列溶液。臨用現配。

 

5.8  微孔濾膜:0.45 μm,有機系。

 

6、儀器設備

6.1  高效液相色譜儀:配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。

6.2  分析天平:精度0.1mg和0.01 mg。

6.3  超聲波清洗器。

6.4  離心機:轉速不低于4000r/min。

6.5 渦旋混勻器。

 

7、樣品

    按GB/T 20195制備樣品,至少200g,粉碎使其全部通過(guò)0.425mm孔徑的分析篩,充分混勻,裝入密閉容器中,避光保存,備用。

 

8、試驗步驟

8.1  提取

    平行做2份試驗。稱(chēng)取0.25g試樣(精確至0.1mg),置于50mL離心管中,加人30 mL 70%甲醇溶液(5.4),渦旋混勻1min,超聲提取10min。于4000r/min離心5min,將上清液轉移至 100 ml,容量瓶中,殘渣再用30mL, 70%甲醇溶液(5.4)提取,重復上述操作,合并上清液,用70%甲醇溶液(5.4)定容,混勻。移取適量提取液,4 000r/min離心5min,用微孔濾膜(5.8)過(guò)濾,備用。宜20h內上機測定。

8.2  色譜參考條件

    色譜參考條件如下:

    a)色譜柱:C柱,柱長(cháng)250mm,內徑4.6mm,粒徑5μm,或性能相當者;流動(dòng)相:A相為水(5.1),B相為乙腈(5.3),梯度洗脫程序見(jiàn)表1;)

    c)流速:1 mL/min;

    d)柱溫:30℃;

    進(jìn)樣量:20μL;e)

    檢測波長(cháng):270nm。

 

表1 梯度洗脫順序

 

時(shí)間/min	A相/%	B相/%
0	75	25
15	75	25
23	70	30
33	48	52
40	48	52
41	75	25
45	75	25

 

8.3  測定

8.3.1 混合標準系列溶液和試樣溶液測定

    在儀器的最佳條件下,分別取混合標準系列溶液(5.7)和試樣溶液(8.1)上機測定。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷I混合標準溶液的高效液相色譜圖見(jiàn)附錄A。

8.3.2  定性

    在相同試驗條件下,試樣溶液中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷1的保留時(shí)間應與混合標準系列溶液(質(zhì)量濃度相當)所對應組分的保留時(shí)間一致,其相對偏差在士2.5%之內。

 

8.3.3  定量

    分別以淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷1的質(zhì)量濃度為橫坐標、對應的色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線(xiàn),其線(xiàn)性相關(guān)系數應不低于0.99。試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度應在標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內,如超出范圍,用70%甲醇溶液(5.4)稀釋后重新測定。單點(diǎn)校準定量時(shí),試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度與標準溶液質(zhì)量濃度相差不超過(guò)30%。

 

 

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